دپارتمان میکروب شناسی دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی تبریز

ارائه دهنده: یونس خلیلی کلوان اساتید راهنما: جناب اقای دک تر محمد تقی اخی جناب اقای دک تر رضا قوطاسلو استاد مشاور: جناب اقای دک تر محمد اقازاده دپارتمان میکروب شناسی دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی تبریز

مقدمه

مشخصات عمومی سودوموناس ائروجینوزا گرم منفی متحرک اکسیداز مثبت هوازی نیاز تغذیه ای ساده ساپروفیت 5 تا 42 درجه حرارت نیز می تواند رشد کند تولید تری متیل امین

پاتوژنز ادهزین تولید الژینات تولید و ترشح برخی انزیم ها االستاز سیتوتوکسن فسفولیپازC رامنولیپید ترشح و تولید برخی توکسین ها

بیماری های بالینی اک تسابی بیماران مزمن ریوی عفونت فولیکولیت کراتیت اندوکاردیت پنومونی اکتسابی ناشایع در عفونت بیمارستانی پنومونی عفونت ادراری عفونت زخم باکتریمی

درمان پنی سیلین های انتی سودوموناس سفالوسپورین هائی وسیع الطیف امینوگلیکوزیدها فلوروکینولونها کارباپنم

مقاومت انتی بیوتیکی پمپ Efflux کاهش نفوذ پذیری غشای خارجی موتاسیون در انزیم DNA ژیراز و انزیم RNA پلیمراز هيدروليز انزيمي ( فسفوريالسيون ادنيالسيون و استيالسيون ) تولید انواع بتاالکتاماز Amp C اگزاسیلیناز متالوبتاالک تاماز بتاالکتاماز های وسیع الطیف ESBLs( )

طبقه بندی بتاالک تاماز ها ) Ambler( طبقه بندی مولکولی کالس ESBLs : A )بتاالکتاماز های وسیع الطیف( کالس : B متالوبتاالکتاماز کالس : C سفالوسپوریناز های گروه ) Amp C( C کالس : D اگزاسیلیناز ها

Bush Group Molecular Class 1 C Attributes of Beta-Lactamase Often chromosomal, may be plasmid mediated. Resistant to all beta-lactamases, except carbapenems. Not inhibited by clavulanic acid. 2a A Include Staphylococcal and enterococcal penicillinases. High resistance to penicillins. 2b A Broad-spectrum beta-lactamases. 2be A ESBLs conferring resistance to oxyimino-cephalosporins and monobactams. 2br A Inhibitor resistant TEM and SHV beta-lactamases. 2c A Carbenicillin-hydrolyzing enzymes. 2d D Cloxacillin-hydrolyzing enzymes; mildly inhibited by clavulanic acid. 2e A Cephalosporinases inhibited by clavulanic acid. 2f 3a,3b,3c A B Carbapenem-hydrolyzing enzymes with active site serine; inhibited by clavulanic acid. Metallo-beta-lactamases conferring resistance to all betalactamases except monobactams.

) بتاالک تامازهای وسیع الطیف ESBLs( تولید در باک تری باعث منوباکتام می شود انواع تمامی به مقاومت مختلف خانواده ها سیلین پنی ESBLs و سفالوسپورین های این انزیم ها به واسطه پالسمیدی و یا کروموزمی منتقل می شوند معموال شوند وسيله به مهارکننده هاي بتاالک تامازها مثل کالوالنيک اسيد و سالباک تام تازوباک تام يا مي مهار ولی باک تری های تولید کننده ESBL نسبت ارتاپنم( به طور معمول حساس می باشند به سفامايسين و مروپنم و پنم )ايمي ها کاربانپم و ها

(Extended spectrum beta lactamases) : تاکنون 181 تیپ گزارش شده است TEM type در P. aeruginosa SHV type :تاکنون 134 تیپ گزارش شده است تیپ گزارش شده است بندرت دیده می شود : تاکنون 98 CTX-M type :OXA type تاکنون 183 تیپ از این دسته گزارش شده که اک ثرا ESBL نیستند GES and SFO, (7 types)per,(7 types )VEB: Other types www.lahey.org/studies

ژن های PER-1 مورد VEB-1 و PER-1 bla ژن مطالعه سال 1993 از یک بیمار ترکیه ای پراکندگی جعرافیای محدودی دارد ( ترکیه ایتالیا ) در بخش های بستری بخصوص ICU بصورت اپیدمی گسترش می یابد محل شیوع کشور ترکیه VEB-1 bla ژن سال 1996 از یک کودک 4 ساله ویتنامی دچار عفونت ادراری.E coli گسترش جعرافیای بیشتری دارد محل شیوع جنوب شرق اسیا

روشهای شناسای ی ESBLs روشهای فنوتیپ ی روش ترکیب دو دیسک ( Disk )Combined روش سینرژی بین دو دیسک ( Test (Double Disk Synergy روش E-test روشهای ملکولی روش ایزوالک تروفوکوسینگ اوليگوتايپينگ PCR

مواد و روش ها

جمع اوري نمونه و تعيين هويت باك تري ها %20 ایزوله های از تیر ماه سال 1387 تا تیر ماه 1388 تعداد 115 ایزوله اطالعات مربوط به نمونه جدا شده در پرسشنامه جمع اوری ایزوله ها برای مطالعات تکمیلی در داخل محیط تریپتیکس سوی داخل فریزر 20- درجه سانتیگراد نگهداری گردید تعیین هویت مجدد کشت در محیط اختصاصی )سترمید اگار( تولید اکسیداز تست :OF هوازی مثبت و بی هوازی منفی با براث در گلیسرول

تعیین الگوی حساسیت انتی بیوتیکی ميزان حساسيت انتي بيوتيک به روش Kirby-Bauer نتايج حاصل با استانداردهاي ارايه شده توسط CLSI مقايسه شد. از سویه استاندارد Pseudomonasبرای aeruginosa ATCC 27853 ارزیابی کیفیت دیسک های انتی بیوتیکی مورد استفاده و صحت روش انجام تست استفاده شد. تعیین MIC سفتازیدیم با روش E-test برای این منظور مشابه روش انتی بیوگرام سوسپانسیونی معادل نیم مک فارلند تهیه و روی محیط مولر هینتون اگار مطابق دستورالعمل شرکت سازنده کشت داده شد و نوارهای حاوی انتی بیوتیک روی ان قرار گرفت و بعد از انکوباسیون در 37 درجه سانتیگراد به مدت 24-18 ساعت نتایج با استانداردهای ارائه شده توسط CLSI مقایسه گردید

تشخیص فنوتیپ ی تولید ESBL کلیه ایزوله های مقاوم به سفتازیدیم )MIC 16µg/ml( با دوروش مختلف از نظر تولید انزیم های ESBL مورد ارزیابی قرار گرفتند. ترکیب دو ديسک CDT( (: از ديسک سفتازيديم سفوتاکسيم و سفپیم همراه با سفتازيديم/کالوالنيک UK( ) MAST Ltd, اسيد سفوتاکسيم/کالوالنيک اسيد و سفپیم/کالوالنیک اسید نيم مک مطالعه در سرم فيزيولوژي به حالت سوسپانسيون تهيه شده و کدورت ان با استاندارد ايزوله هاي تحت فارلند تنظیم شد روي محيط کشت مولرهينتون اگار حاوی 250µg/ml پودر کلوگزاسیلین کشت داده شد و سپس انکوبه شدند افزايش 5 ميلي متردر اندازه قطر هاله عدم رشد در اطراف ديسک هاي دارای مهارکننده بتاالکتاماز نسبت به دیسک های بدون مهارکننده بيانگر تولید.ESBL

سینرژی دیسک دو بین :) تشخیص فنوتیپ ی تولید ESBL DDST( سفتازیدیم سفوتاکسیم سفپیم و ازترونام به فاصله 20 میلی متر از هم و از دیسک اموکسی سیلین کالوالنیک اسید که در مرکز است قرار می دهیم ايزوله هاي تحت مطالعه در سرم فيزيولوژي به حالت سوسپانسيون تهيه شده و کدورت ان با استاندارد نيم مک فارلند تنظیم شدروي محيط کشت مولرهينتون اگار حاوی 250µg/ml پودر کلوگزاسیلین کشت داده شد گسترش هاله عدم رشد از طرف دیسک حاوی مهار کننده به سمت دیسک بدون مهارکننده بتاالکتاماز به عنوان ESBL مثبت تلقی می شد از سویه های دارای ژن های مورد مطالعه به عنوان کنترل مثبت و از سویه استاندارد.P aeruginosa ATCC 27853 به عنوان کنترل منفی در هر دو روش فنوتیپی استفاده شد

) روش شناسای ی مولکولی PCR( به سفتازیدیم به بودند DNA کلیه ایزوله های که دارای MIC 16µg/ml نسبت روش SDSپروتئیناز K اصالح شده با CTABاستخراج شد. ) انرا در که OD جهت تعيين میزان خلوص DNA استخراج شده موج 280nm و 260nm مورد ارزیابی قرار گرفت و 1/9 داشتند برای کار ملکولی استفاده شدند. جذب نوري OD( DNAایزوله هائی دو طول بین 1/7-

اجزاء واکنش PCR Material Per Reaction For 15 Reaction Mix dntp 1 μl 16 μl MgCl 2 2.2 a μl 2.4 b µl 35.2 μl 38.4µl 10X Buffer 5 μl 80 μl F and R Primers 0.5 m mol 2 μl 32 μl Taq Polymerase 0.5 μl 8 μl Total 10.7-10.9 μl 171.2-173.4 μl bla PER-1 : b bla VEB-1 برای ژن و برای ژن :a

واکنش PCR بااستفاده از پرایمر های اختصاصی در دستگاه ترموسایکر در 35 سیکل انجام شد و محصول PCR در ژل اگاروز %1/1 الک تروفورز گردید. از سویه استانداد.P.P به عنوان کنترل منفی و نیز از سویه aeruginosa ATCC 27853 aeruginosa KOAS و.P aeruginosa 10.2 به ترتیب به عنوان کنترل مثبت ژن های PER-1 bla و VEB-1 blaاستفاده شد ) مدت زمان )دقیقه( درجه حرارت )C مراحل انجام ازمايش ترتيب توالي نوکلئوتيدي 5ʹ-ACACAAATGCCAGGCAAAGT-3ʹ 5ʹ-TTTAACCGCTCTGGTCCTGT-3ʹ 5'- CGACTTCCATTTCCCGATGC-3' 5'-GGACTCTGCAACAAATACGC-3 عنوان ژن For-PER-1 Rev PER-1 For-VEB-1 Rev-VEB-1 First Denaturation 94 5 Denaturation 94 1 Anneling 52 a 53 b 1 Extention 72 1 Final extention 72 10

نتایج

تعداد ایزوله های جمع آوری شده و تعداد ESBL مثبت Ward ICU Burn Internal Surgery Urology Truma Nephrology Total Isolates 55 16 16 16 4 1 7 115 ESBLs Positive 14 12 2 9 1 0 0 38

نتیجه الگوی حساسیت انتی بیوتیکی %62 ایزوله مقاوم به سفوتاکسیم و 76 %حساس به کارباپنم ها بودند که به ترتیب حائز بیشترین مقاومت و حساسیت را نسبت به انتی بیوتیک ها داشتند %43/5 ایزوله از کل ایزوله ها MDRبودند )حداقل به 3 گروه مختلف انتی بیوتیک مقاوم بودند( PB GM IMI PTZ CRO CTX CIP MEM ATM CAZ CPM

جدول الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی ایزوله های سودوموناس ائروجینوزا حساس نیمه حساس مقاوم انتی بیوتیک ) 7( ) 31( ) 62( سفوتاکسیم ) 24/5( ) 15( ) 60/5( سفتریاکسون ) 33/5( ) 14( ) 52/5( ازترونام ) 36/5( ) 9( ) 54/5( سیپروفلوکساسین ) 48( ) 2( ) 50( جنتامیسین ) 50( ) 3( ) 47( سفپیم ) 55/5( 0 ) 44/5( سفتازیدیم ) 75( 0 ) 25( پیپراسیلین- تازوباکتام ) 76( ) 3( ) 21( مروپنم

MIC سفتازیدیم 46 ایزوله دارای MIC 16µg/ml بودند )R ) و 4 ایزوله MIC بین 4-8µg/ml داشتند و 65 ایزوله MICکمتر از 4 را µg/ml نشان دادند) S )

تولید ESBL با روش CDT از 46 ایزوله مقاوم به سفتازیدیم )MIC 16µg/ml( با این روش 38 ایزوله ESBL مثبت شناخته شدند که % 82 از ایزوله های مقاوم به سفتازیدیم را شامل می شود. CAZ/CV CTX/CV CAZ CPM/CV CTX CPM

تولید ESBL با روش DDST از 46 ایزوله مقاوم به سفتازیدیم با این روش تنها 13)%28/2( ایزوله به عنوان تولید کننده های انزیم ESBLشناخته شدند. همه این ایزوله ها با روش قبلی CDT( ) نیز مثبت بودند. CTX CAZ AUG CPM ATM

) نتایج بررسی ملکولی PCR( %36 از 46 ایزوله مقاوم به سفتازیدیم 17 ایزوله مولد PER-1 bla ایزوله های مقاوم به سفتازیدیم تشکیل می دهد. ژن شامل که بودند 1 2 3 4 5 920 bp ستون 1 و 2 : ایزوله های مولد ژن ستون 3: کنترل مثبت.P a KOAS ستون 4 : کنترل منفی P. a ATCC 27853 ستون 5: سایز مارکر 100 bp 1021 bp 900 bp 500 bp

از ) نتایج بررسی ملکولی PCR( که بودند VEB-1 bla این شامل 46 ایزوله مقاوم به سفتازیدم 12 ایزوله مولد ژن %26 ایزوله های مقاوم به سفتازیدیم تشکیل می دهد. ستون 1 : سایز مارکر 100 bp ستون 2 و 3 : ایزوله های مولد ژن ستون :4 کنترل منفی P. a ATCC 27853 ستون 5 : کنترل مثبت.p a 10.2 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 700 bp 600 bp 500 bp 640bp

میزان مقاومت انتی بیوتیکی در ایزوله های ESBL مثبت و مولد ژن های PER-1 و n(%) VEB-1 انتی بیوتیک ایزوله های ESBL مثبت 38=n 17=n ایزوله های PER-1 مثبت ایزوله های VEB-1 مثبت n==12 98( ) سفتریاکسون ) 97( )100( 98( ) سفوتاکسیم ) 97( )100( 98( ) ازترونام ) 97( )100( 94( ) سفپیم ) 87( )94( 83( ) جنتامیسین ) 71( )78( 84( ) سیپروفلوکساسین ) 71( )89( پیپراسیلین- تازوباکتام ) 36( ) 52( )39( 32( ) مروپنم ) 42( )22( )26 ) ایمی پنم ) 39( )28(

بحث

تشخیص تولید ESBL با روشهای دلیل زیر دارای نتایج کاذب است. فنوتیپ ی در سودوموناس ائروجینوزا همانند انتروباک تریاسه به و باشد نمی راحت 1 )وجود انواع مختلف بتاالکتاماز )C Amp و متالوبتاالکتاماز و اگزاسیلیناز( 2 )وجود سیستم Efflux قوی و مقاومت برخی تیپ های ESBL به مهار کالونیک( کننده مهار گی کننده بتاالکتاماز) اسید باعث که شد ارائه افزایش تشخیص در مثبت موارد اما روش های اصالح شده در سال 2006 توسط Jiang سودوموناس ائروجینوزا می شود افزودن کلوگزاسیلین به محیط کشت کاهش فاصله دیسک ها از 30 به 20 میلی متر افزودن مهار کننده پمپ Efflux به محیط کشت روش های مولکولی استاندارد طالئی می باشد

جدول شیوع میزان تولید ESBL با روش های فنوتیپی در ایزوله های مقاوم به سفتازیدیم سودوموناس ائروجینوزا ESBL مثبت )%( سال کشور 1 (استفاده از روش های اصالح شده 2 (محل جمع اوری ایزوله 2003 20.6 تایلند 2005 25.4 کره جنوبی 2006 23.4 بولیوی 2007 28.7 بلغارستان ایران )تهران ) 2008 40 2006 45.3 چین 2010 82 مطالعه حاضر

bla PER-1 میزان شیوع ژن سودوموناس ائروجینوزا در ایزوله های مقاوم به سفتازیدیم ژن PER-1 مثبت )درصد( سال کشور 1997 38 ترکیه 2005 55.4 ترکیه ترکیه * 2005 86 ایران )تهران ) 2007 13 ایران )تهران ) 2008 18 2006 34.6 ایتالیا 2010 36 مطالعه حاضر 2006 0 چین 2007 0 بلغارستان **ایزوله جمع اوری شده از ICU

bla VEB-1 میزان شیوع ژن در ایزوله های مقاوم به سفتازیدیم سودوموناس ائروجینوزا کشور سال ژن VEB-1 مثبت )درصد( تایلند 2001 93 2006 38.6 چین 2008 80 انگلستان بلغارستان 2007 33.1 ایران )تهران ) 2007 11 2010 26 مطالعه حاضر

نتیجه گیری با توجه به افزایش موارد ESBL مثبت و تاثیر ان در افزایش مقاومت انتی بیوتیکی سودوموناس ائروجینوزا لزوم تشخیص موارد مثبت و تعیین دقیق الگوی حساسیت انتی بیوتیکی این ایزوله ها ضروری می باشد. در صورت مشاهده مقاومت به سفالوسپورین های وسیع الطیف استفاده از یک کارباپنم به جای سفالوسپورین همراه با یک انتی بیوتیک غیر بتاالکتام نظیر امینوگلیکوزید یا پیپراسیلین تازوباکتام می تواند مفید باشد. در صورت بروز اپیدمی احتمالی با ایزوله های ESBL مثبت در بخش ICU می توان با افزایش بهداشت و معیار های بهداشتی استفاده از انتی سپتیک های مناسب نظیر نیترات نقره و اجتناب از جابجای ی افراد بستری در بخش ICU از گسترش این ژنها جلوگیری کرد.

با تشکر فراوان